Volume EM ~ Techniques d’acquisition et de reconstruction 3D des échantillons ~

Techniques d’observation et d’analyse de la structure d’un échantillon qui fait appel à la reconstruction 3D à partir d’images de microscopie électronique.

Il existe 2 familles de 3D en microscope électronique :

• La première passe par la création de stacks d’images en 2D en cross section sur MEB ou le FIB (array tomography, « SBF » Serial Block Face ou FIB 3D).
• La seconde passe par le calcul des projections images de l’échantillon tilté obtenues en MET (tomographie).

L’Array Tomography est la technique de référence pour la 3D d’échantillons tels que les tissus biologiques. L’imagerie de chaque section (ou de zones d’intérêts sur chaque section) est faite avec un MEB, le volume reconstruit final est l’assemblage du stack d’images. L’Array Tomography est une technique non destructive, les coupes obtenues par ultramicrotomie sont déposées sur wafer ou lame de verre avec dépôt conducteur et sont conservées.

La surface d’un échantillon enrobé en résine est coupée par un ultramicrotome spécifique in-situ (dans la chambre du MEB) et la surface du bloc est imagée en électrons rétrodiffusés à basse tension dans la foulée. En répétant l’opération automatiquement, on obtient une série d’images 2D du bloc. L’assemblage des images du stack nous permet d’obtenir la visualisation 3D complète du bloc. Des extractions ultérieures de zones (segmentations) ou d’objets d’intérêts (cellules, organelles, etc.) permettent de révéler les structures 3D d’objets µmétriques. Coupes et observations sont enchainées automatiquement grâce aux logiciels dédiés. Les coupes échantillons étant « sacrifiées » , cette technique est destructive.

_{* Deerinck, T. J., Bushong, E., Thor, A. & Ellisman, M.H. NCMIR methods for 3D EM: A new protocol for preparation of biological specimens for serial block-face SEM. Microscopy (Oxf),6-8. (2010)}

Comme pour la technique SBF, des cross sections sont réalisées et imagées directement à la suite. En fin d’acquisition une reconstruction 3D est obtenue par assemblage du stack d’images 2D. Les échantillons seront au préalable enrobés et contrastés avec des métaux lourds selon différents protocoles. Cette technique à plusieurs avantages : elle permet une grande précision de positionnement de la découpe, présente des distorsions plus faibles et une meilleure résolution 3D (sur le plan en Z due à l’épaisseur des coupes =20nm). Cette technique permet aussi de s’affranchir des inconvénients liés à la découpe mécanique et permet de découper tous types d’échantillons : durs, fragiles, cassants, comme des dents, os, métaux, silicium, etc. Les coupes échantillons étant « sacrifiées » , cette technique est destructive.

La tomographie en MET permet d’observer les structures fines contenues dans des coupes d’échantillons de quelques 10nes de nm à une 100ne de nm d’épaisseur. Les reconstructions par calculs (qui utilisent les images des projections de l’échantillon tilté en continu) permettent de visualiser en 3D des structures intracellulaires, protéines ou organelles de très petites tailles en très haute résolution.